بررسی بیان ژن در شرایط تنش سرما در گیاه بنفشه

گیاه بنفشه گیاهی زینتی و متعلق به خانواده ویولاسه (violacea) است که دارای گونه های متعددی می باشد. یکی از مهمترین گونه های بنفشه، یک گونه دورگ با نام v.wittrockiana بوده که به دلیل تحمل بالا به سرما، در سراسر جهان از محبوبیت زیادی برخودار است. به منظور مطالعه الگوی بیان ژن در شرایط دماهای پایین از برگ های این گیاه در دمای 25 درجه سانتیگراد به عنوان نمونه شاهد و دماهای 5 ، صفر، 5- و 10- درجه سانتیگراد نمونه برداری شد. با کمک روش نماش افتراقی (differential display or rap- pcr) به بررسی تفاوت بیان ژن ها پرداخته شد. روش نمایش افتراقی روشی قدرتمند در جهت بررسی بیان ژن است که در سال 1992 ابداع شد. استخراج rna از برگ های بنفشه برای هر پنج تیمار دمایی انجام شد. با کمک آنزیم رونویسی معکوس و با استفاده از سه آغازگر اولیگو (اولیگوdta، اولیگو dtc و اولیگو dtg)، ساخت رشته اول cdna انجام شد. در مرحله بعد از هشت آغازگر انتخابی با طول 13 نوکلئوتید استفاده گردید. آغازگرهای مورد استفاده شامل، hap25 ، hap26 ، hap27 ، hap28 ، hap29 ، hap30 ، hap31 و hap32 بودند که به همراه آغازگرهای اولیگوی مورد استفاده در مرحله ساخت رشته اول cdna ، در واکنش pcr با استفاده از دستگاه ترموسایکلر اپندرف در ساخت رشته دوم cdna به کار رفتند. جداسازی باندها روی ژل پلی اکریل آمید غیر واسرشت ساز 19 درصد در دستگاه الکتروفورز عمودی انجام شد. رنگ آمیزی ژل پلی اکریل آمید با استفاده از محلول نیترات نقره انجام گرفت و با کمک اسکنر از روی ژل تصویر برداری شد. نتایج نشان داد که از میان سه آغازگر اولیگو، آغازگر اولیگو dtc بیشترین تعداد باند را تولید کرد. از میان آغازگرهای انتخابی نیز آغازگر انتخابی hap30 برای مجموع سه آغازگر اولیگو، بیشترین تعداد باند را ایجاد کرد. روندی که برای تعداد باند ایجاد شده روی ژل پلی اکریل آمید مشاهده شد بدین صورت بود که تعداد باندهای تیمار دمایی 5 درجه سانتیگراد نسبت به دمای شاهد(25 درجه) بیشتر بود اما تعداد باندها در دمای صفر درجه کاهش یافته و در دمای 5- درجه به حداکثر تعداد خود رسید. در دمای 10- درجه مجدداً تعداد باند نسبت به دمای 5- درجه کاهش یافت. به نظر می رسد بهترین دما از میان دماهای به کار رفته در این تحقیق به عنوان تیمار دمای پایین، از نظر تعداد باند ایجاد شده و برای بررسی تفاوت بیان ژن، دمای 5- درجه سانتیگراد باشد. در کل برای تیمارهای دمایی اختلاف باندها کاملا مشهود بود.